Планируем покрасить клетки для цитометрии (1): контроли

Меня часто спрашивают недавно спросили, можно ли отсортировать клетки с нокаутом гена поверхностного белка, окрашивая мишень антителами. Это сложнее, чем отсортировать клетки с повышенной экспрессией, потому что требует аккуратной пробоподготовки.

Вообще любой эксперимент по цитометрии - да и с помощью других методов - включает в себя постановку задачи с выбором модели и критериями оценки результата, пробоподготовку и оптимизацию протокола измерения. Каждый этап требует оптимизации и контролей, особенно если необходимо достоверно убедиться в отсутствии экспрессии. Предположим, что мы уже выбрали клетки и антитела и хотим отработать протокол.

1️⃣Контроли для пробоподготовки
Мы можем красить клетки первичными мечеными антителами, что встречается чаще, или немечеными первичными + мечеными вторичными.

🧪 Чтобы убедиться, что сигнал пропорционален количеству мишени, необходимо оптимизировать концентрацию антител, для чего надо их оттитровать и определить индекс окрашивания (stain index). Об этом подготовительном эксперименте напишу в отдельном посте.

🧪 Для того, чтобы определить фон и выявить неспецифику, - особенно для поставленной выше задачи - имеет смысл поставить технический негативный контроль.

🔸Иногда в случае первичных меченых антител используют изотип-контроли (антитела того же изотипа и с тем же флуорохромом, которые не связывают никакие мишени в клетках), но я бы предпочла для отрицательного контроля покрасить нужным антителом клетки, не экспрессирующие мишень. В качестве примера с маленькой натяжкой могу привести окраску антителом к CD8 CD4 T-клеток. Такой контроль характеризует не только антитело, но и то, насколько оптимизирован протокол пробоподготовки.

🔸В случае непрямого окрашивания необходимо оптимизировать оба антитела. Сначала оптимизируем вторичное: окрашиваем только вторичным антителом (технический отрицательный контроль) и с первичным антителом. Выбираем концентрацию, при которой есть сигнал при окрашивании вместе с первичным антителом, но нет сигнала при окрашивании только вторичным, и уже потом титруем первичное.

2️⃣Контроли для измерения и оценки сигнала
Чтобы определить положительную популяцию, надо поставить гейт относительно отрицательной популяции, для чего используется FMO (fluorescence minus one) контроль - тот же образец, окрашенный всеми антителами, кроме интересующего. В случае непрямого окрашивания можно окрашивать негативный контроль только вторичным антителом.
Использовать для гейтирования контроли из пункта 1 (изотип и окрашенные клетки, не экспрессирующие мишень) - с моей точки зрения, неудачная идея, хотя говорили, что так делают.

#FAQs_про_FACS
#flowwithglow

Сортировка клеток для нокаутов

1️⃣Начать необходимо с оптимизации пробоподготовки, чтобы мы были уверены, что редактируемые клетки экспрессируют мишень и специфично и селективно окрашиваются.

2️⃣Независимо от того, вносим ли мы гиды и Cas трансфекций или лентивирусной трансдукцией, искомых клеток довольно мало и перед отбором нужных стоит обогатить популяцию трансфицированными или трансдуцированными клетки антибиотиком или сортировкой в зависимости от маркера селекции в генетических конструкциях.

3️⃣А когда клетки подрастут, уже можно отсортировать популяцию, в которой нет сигнала, ориентируясь на положительный (от окрашенной популяции дикого типа) и отрицательный (не окрашенному антителами к мишени образцу) контролям.

❗️В случае сортировки негативной популяции важно подобрать вольтаж так, чтобы поместить ее полностью в положительную область. Во-первых, на приборах BD просто не будет сортировать популяция, содержащая клетки с сигналом ниже нуля, а во-вторых, для детекции редких событий важно, чтобы сигнал от них превышал электронный шум.

#FAQs_про_FACS
#flowwithglow