Be-real-not-surreal (1): РНК
Purity, Integrity, Inhibition (c) MIQE

Для рутинного выделения РНК мы пользуемся фенольным ("тризольным") методом, потому на 🐳 я жертвовать почку пока не готова в силу столь же 🐳 (больших) масштабов.

✍Наша рутинная методика следующая. Мы выделяем с помощью еврогеновского ExtractRNA, но с двумя моментами:

1) дополнительной стадией абсента с лаймом переосаждения в 70% этаноле с ацетатом натрия (pH 4.8) после IPA. В оригинальной методике написано, что она опциональна, но она хорошо очищает от органики. Оставляем на -20 от получаса до недели, потом 70% спирт и хэппи-энд.

2) с дополнительным центрифугированием в феноле в самом начале - перед экстракцией - для удаления геномной ДНК. В ряде методик она указана. Это позволяет на последующей стадии с хлороформом хорошо провортексировать, что увеличивает выход РНК.

3) Кстати, в методичке для ExtractRNA есть ошибка: для осаждения РНК изопропанолом недостаточно просто смешать со спиртом и взболтать - необходимо подержать РНК с ним 15-20 минут при комнатной температуре - а для ДНК достаточно 5.

🕛 С лунки 12-луночного планшета чаще всего выделяется 5-10 мкг, если клетки некрупные (у нас стандартные опухолевые линии) и финальная конфлюэнтность клеток 70-90%. В случае, если хватает реактивов, а конфлюэнтность должна быть ниже или клетки очень крупные, будет спокойнее выделять с чашки/лунки калибра 35 мм. Чтобы мучительно не рассматривать осадки, как в мемах.

#surrealtime #лабораторный_могул

Be-real-not-surreal (2): ОТК РНК и ОТ
Purity, Integrity, Inhibition (c) MIQE

Протоколы для выделения РНК могут быть разными, но я убеждена, что лучше потратить час на раскап и форез, чем потом гадать, что случилось с образцом.

✍ После выделения РНК мы всегда ставим электрофорез в 1% агарозном геле с этидием на 40-60 мин. А для скорости мы капаем образцы в планшеты Терасаки - как для NanoDrop, так и для фореза.

Насколько критичны значения от NanoDrop - вопрос, мне кажется, дискуссионный, но низкие соотношения 260/230 (контаминация органикой) у нас действительно коррелировали с ингибированием ПЦР, по результатам оценки эффективности праймеров. На значения 260/280 (контаминацией геномной ДНК), поскольку подбираем праймеры так, чтобы не нужно было обрабатывать ДНКазой: т.е. чтобы один отжигался на границе экзонов или праймеры были разделены большими интронами. Это решает основные проблемы, кроме наличия псевдогенов, что у нас встречалось нечасто. Но опять же, мы проверяем на количество геномной ДНК электрофорезе и ставим NRT контроль: либо нормальный RT-, либо просто разведенные аликвоты РНК.

(Кстати, если смотреть не с помощью гельсканирующей системы, а трансиллюминатора с ультрафиолетом, то смотреть РНК чаще можно только один раз.)

✍ Для синтеза первой цепи используем случайные гексамеры (от "ДНК-синтез"), поскольку наши праймеры отжигаются на очень разных участках кДНК. Когда-то давно пробовала декамеры от Еврогена, но мне не понравилось, выход ниже. Oligo-dT не используем, потому что праймеры отжигаются в различных местах, зачастую далеко от 3'-конца. Количество РНК стараемся брать одинаковое, чтобы было проще отслеживать возможные выбросы в результатах реал-тайма.

Пользуемся ревертазой Mint от Еврогена. Мы в приступе желания покапать подушнить выбрать лучшее однажды взяли одинаковое количество одной и той же РНК, сделали строго по методике ревертирование тремя ревертазами от Еврогена: MMLV, Mint и Magnus - и прогнали на ПЦР с праймерами на ген домашнего хозяйства (тубулин или TBP). С большим отрывом победила Mint: мятная кДНК оставила позади соперников и вышла на несколько циклов раньше, - и в итоге мы решили продолжать использовать именно ее. В относительно ближайшее время Биолабмикс обещает привезти пробник ревертазы, чтобы мы сравнили с Mint.

#surrealtime #лабораторный_могул #импортозамещение